НОВОСТИ

Флуориметрия. Раздел из ненаписанного учебника агронома

ТЕГИ:

Итак, мы погружаемся в методику, которая только возникает для практического применения в полях: у вас есть проблема, растения слабы, их кондиция ниже нормы... Вы берете в руки - точнее, в руку, он помещается в одной руке, - флуориметр и в течение нескольких минут получаете ответ, в чем ваша проблема заключается. И, быть может, все еще можно исправить.

Давайте рассмотрим механизм этого метода подробнее.

Два типа приборов для мгновенного анализа состояния растения

Флуореценция хлорофилла: полезный (практический) инструмент

Мухамед Хазем КалаиМухамед Хазем Калаи Mohamed Hazem Kalaji

Department of Plant Physiology, Warsaw Agricultural University SGGW Перевод с английского - Н.А. Уляницкая

Продолжаем наше знакомство с флуориметрией. Метод, определяющий фотосинтетическую активность растения, а, значит, и будущую его урожайность, не совсем прост в теории, в понимании, но очень прост в применении. Его главные преимущества - простота и быстрота. Вам не нужно отбирать образцы на поле, вырывать растения или же его части, ехать в лабораторию.

Весь сложнейший анализ может проводить любой человек на поле. И времени занимает совсем немного: одно типичное измерение длится одну секунду, но обеспечивает массу информации. Как-то не сразу верится, правда? Что же за такой короткий срок может уловить прибор?

Флуориметр, работа которого основана на измерении интенсивности флуоресценции (отсвечивании) хлорофилла, фиксирует интенсивность не постоянной, а кратковременной флуоресценции, которая наблюдается, когда растение интенсивно освещается после затемнения. Такая быстрота получения результата позволяет обследовать сотни растений за час. Многие селекционеры уже применяли этот способ в своих исследованиях как критерий селекционного отбора и подтвердили, что он обеспечивает достоверную информацию о фотосинтезе, который имеет прямое отношение к конечному урожаю культур. Кроме интенсивности отсвечивания хлорофилла, флуориметр фиксирует много других ее параметров, которые могут использоваться как дополнительные или проверочные, надежные индикаторы. Цель статьи - рассказать об этих параметрах, чтобы вы умело использовали полученные знания для достижения своих целей.

Измерения флуоресценции хлорофилла

Хлорофилл - зеленый пигмент растений - непосредственно участвует в нескольких физиологических процессах. Изучая его флуоресценцию, мы косвенно изучаем другие уровни фотосинтеза (например, процессы на уровне пигментов, первичные световые реакции тилакоидов, реакции движения электронов, темновые ферментные реакции, медленные регуляторные процессы). Эти показатели часто являются определяющими для физиологического состояния растений. Проявление влияния стрессовых условий у растений происходит на том этапе, когда большинство физиологических процессов уже необратимы. В предыдущей статье неоднократно упоминалось, что фотосинтез - наилучший индикатор для определения состояния растения на уровне клеток. Дело в том, что процесс фотосинтеза часто замедляется в растениях, подвергающихся влиянию даже кратковременных неблагоприятных условий - дефицит воды, температура, недостаток питательных веществ, конкуренция сорняков, проникновение возбудителей болезней (Araus и др., 1998). Следовательно, анализ параметров флуоресценции хлорофилла считается важным методом для оценки здоровья, внутренней целостности растения в пределах надземной части культуры (Krause и Weiss, 1991; Clark и др., 2000). Это также быстрый и точный способ диагностики и определения степени устойчивости растения к неблагоприятным или стрессовым условиям (Li и др., 2006). Более того, новое направление в физиологии растений (изучающее нейронную междуклеточную связь) показало, что измерение интенсивности флуоресценции хлорофилла - это один из наиболее перспективных методов для определения (идентификации) вида растений и может также применяться для определения состояния растений без наличия какой-либо первичной информации (Codrea и др.,2003). Формирование с помощью флуориметров изображения кривой интенсивности флуоресценции хлорофилла поможет понять изменения, которые происходят в растении (Lawson и др., 2002; Moya и Cerovic,200).

Флуоресценция хлорофилла - явление не очень сложное. Его суть заключается в способности зеленого пигмента - хлорофилла - поглощать, а потом излучать (отсвечивать) световую энергию и длинные волны света. Длительность такого излучения хлорофиллом определяется двумя факторами: количеством света, поглощенного растением, и уровнем конкуренции за световую энергию с другими энергетическими процессами, которые происходят в растении (в основном, это процессы образования новых веществ и отдачи тепла в растении). Если хлорофилл начинает меньше поглощать света, значит, его конкуренты получают световой энергии больше. Следовательно, изменения в интенсивности флуоресценции отражают изменения в эффективности образования новых веществ - будущего нашего урожая (Hnstch, 2007). Схематично это можно показать следующим образом (рис. 1). В течение последних десятилетий развитие электроники способствовало появлению доступных многим приборов для измерения сигналов флуоресценции хлорофилла из любой части растения, в которой происходит фотосинтез. Ознакомимся с ними детальнее.

Рис.1. Предназначение поглощаемого растением света
Рис.1. Предназначение поглощаемого растением свет: поглощение и отсвечивание хлорофиллом, образование новых органических веществ, преобразование в тепло, излучаемое растением (Courtesy of Hnstch Instr Ltd., Narborough Road, Pentney, King's Lynn, Norfolk PE32 1 JL, Англия)

Тип первый - прибр длительной индукции (стимуляции) хлорофилла

Флуориметр длительной стимуляции предназначен для измерения интенсивности свечения хлорофилла, которое возникает после кратковременного отсутствия света. Физиологи называют этот процесс быстрой индукцией флуоресценции или индукцией Каутского - по имени ученого, который исследовал данное явление еще в 1931 году (Kautsky и Hirsch, 1931). Раньше для изучения образца растения закрывали специальным экраном, не пропускающим длинные (красные) волны света. Исследования проводились в комнате, оборудованной специальными лампами зеленого света, после нескольких минут пребывания растений в темноте. Теперь с помощью флуориметров измерения можно проводить в поле, присоединив датчики-зажимы к любой (интересующей вас) зеленой надземной части растения. На экране флуориметра появляются разные цифры, буквы, графики, которые, на первый взгляд, ничего о растении нам не рассказывают (рис. 2).

Рис. 2. Основные параметры флуоресценции хлорофилла
Рис. 2. Основные параметры флуоресценции хлорофилла, измеренные с использованием флуориметров длительной стимуляции хлорофилла (Courtesy of Hnstch Instr Ltd)

Но это только на первый взгляд... Оказывается, с помощью такого флуориметра мы можем измерять несколько метрических показателей.

Первый показатель - уровень (интенсивности) выделения световых волн хлорофиллом - обозначается символом Fo.

Параметр Fo показывает, сколько поглощенного раньше света выделяют молекулы хлорофилла. Для фиксирования данного уровня нужно, чтобы в клетках растения произошла сложная реакция - окисление первого стабильного электронного акцептора фотосистемы, названного Qa. Другими словами, необходимо, чтобы те молекулы, которые в клетках растения принимают световые волны, соединились с молекулами кислорода и начали передавать световую энергию к другим молекулам клетки, которые начнут этот свет излучать из клетки. (Все знакомы с подобным явлением - помните, как светятся в темноте приборы, игрушки, брелоки от ключей и т.д., имеющие в своем составе белый фосфор. Принцип в растении такой же.) Реакция окисления происходит мгновенно, даже быстрее, чем вы читаете эти строки, - несколько наносекунд (одна миллиардная секунды). И все фиксирует флуориметр, что подтверждает его высокую чувствительность. Интенсивность Fo изменяется во времени.

Второй показатель - максимальный уровень излучения света хлорофиллом - обозначается символами Fp или Fm.

Это параметр, показывающий максимальный уровень флуоресценции за определенный отрезок времени. На приборе он обозначается одним из символов: Fp или Fm. Почему так? Все очень просто. В зависимости от времени измерения, молекулы, которые принимают волны света, успевают или же, наоборот, не успевают полностью соединиться с кислородом. Если молекулы успели поглотить все необходимые волны света и полностью соединиться с молекулами кислорода, то на экране появляется символ Еш, максимально возможный для изучаемого растения уровень флуоресценции хлорофилла. Если на момент проведения измерения не очень солнечная погода или интенсивность света недостаточно высокая и растение не может полностью насыщаться кислородом на протяжении всего измерения, то на экране прибора появляется значение Ер, максимальная интенсивность флуоресценции за период измерения.

Третий показатель - Fv.

Параметр Fv - временная величина и вычисляется флуориметром как разница между первыми двумя показателями, то есть от уровня флуоресценции хлорофилла растения вычитается максимально возможный уровень флуоресценции хлорофилла.

Четвертый показатель - соотношение Fv/Fm.

Fv/Fm - параметр, который широко используется, чтобы оценить максимальный уровень фотосинтеза для этого растения. Наглядно демонстрирует наличие стресса в растении. Каким образом? Здоровые, не подвергающиеся стрессу растения, в оптимальных условиях, как правило, имеют соотношение Fv/Fm примерно 0,85. Если этот показатель меньше - растение испытывает негативное влияние внешних факторов. По этому показателю можно оценить и уровень стресса.

Пятый показатель - Тfm.

Тfm - параметр, показывающий время, за которое был достигнут максимальный уровень флуоресценции (Fm). Если растение находится в стрессовых условиях - показатель Тfm ниже оптимального времени.

Шестой показатель - индекса продуктивности растения - Р1.

Индекс продуктивности (Р1) - это, по существу, индикатор жизнеспособности растения. Он является общим показателем устойчивости растения к влиянию негативных условий (неблагоприятных, ограничивающих) внешней среды. Показывает, на сколько растения культуры самостоятельно могут справиться со стрессом, изменяя или сохраняя свою продуктивность.

Флуориметры, работающие по принципу измерения интенсивности кратковременной флуоресценции хлорофилла, называются «измерители воздействия стресса на растение». Обычно эти приборы портативные, легкие и с программным обеспечением для дальнейшего анализа полученных параметров. Как пример - карманный флуориметр хлорофилла РЕА (фото 1).

Фото 1. Карманный флуориметр хлорофилла РЕА
Фото 1. Карманный флуориметр хлорофилла РЕА предоставляет доступный и удобный способ для быстрого обследования растения, затратив 1 секунду на измерение быстрой динамики флуоресценции хлорофилла

Второй тип - прибор с системой модулирования светового сигнала (импульса)

Одно из наиболее значимых преимуществ таких флуориметров - возможность проводить обследования растений в любых погодных условиях непосредственно в поле. Прибор фиксирует показатели флуоресценции хлорофилла в естественном оптимальном для растения освещении, а если освещения недостаточно - самостоятельно моделирует необходимый сигнал-импульс, который заменяет необходимый уровень освещения. С помощью таких флуориметров можно смоделировать максимально возможную продуктивность культуры в имеющихся условиях вашего поля. Кроме показателей интенсивности флуоресценции хлорофилла, продуктивности растений, флуориметр фиксирует и другие показатели. Типичный пример показан на рис .3.

Рис. 3. Параметры флуоресценции хлорофилл
Рис. 3. Параметры флуоресценции хлорофилла, измеряемые флуориметром с системой модуляции импульса

Fo - уровень флуоресценции растения.

Fm - максимально возможный для обследуемого образца растений уровень фотосинтеза.

F - уровень флуоресценции, наблюдаемый в любое время светового дня.

F'm - максимальный уровень флуоресценции при наличии света.

F'o - минимальный уровень флуоресценции растением при отсутствии света.

ML - количество света.

SP - уровень насыщения растения световыми волнами.

AL - уровень света, который используется в фотосинтезе.

FR - дальний красный свет, не принимающий участие в фотосинтезе (van Kooten и Snel, 1990).

Приборы для измерения флуоресценции хлорофилла такого типа называются флуориметрами с системой модулирования светового сигнала. Типичным примером является флуориметр хлорофилла FMS-2 (главное фото статьи).

Что могут определять флуориметры?

Согласно Strasser и др. (2000), есть четыре основные группы вопросов, на которые можно ответить, используя флуориметры.

1-й тип - наличие химического стресса.

Существуют стабильные показатели уровней фотосинтеза в определенных условиях: влияние воздействия химических веществ аллелопатии (выделения других растений - культуры или сорняков), гербицидов, регуляторов роста, удобрений, СО2, О2, SO2 или других газов и т.п.

2-й тип - наличие физического стресса.

Флуориметр сравнивает показатели со стабильными величинами в разных условиях интенсивности света или температуры.

3-й тип - наличие смешанного химического и физического стрессов.

4-й тип - биообследования. Проводятся постоянно с определенным интервалом времени, чтобы:

  • изучить реакцию растений (или даже растительного сообщества) во времени с точки зрения его жизнеспособности, продуктивности и реакции на стресс;
  • изучить связи структура-функция на трансгенных растениях.

Подытожим...

Как точно отметил канадский ученый биоинженер Strasser, флуориметры - уникальные приборы, позволяющие определять множество биологических показателей не только ученым, а каждому заинтересованному человеку. С помощью флуориметра можно получить информацию - начиная с определения сельскохозяйственной продуктивности растений каждой культуры с учетом влияния типа земледелия, гербицидов, пестицидов, регуляторов роста, сортов, факторов окружающей среды, которые могут вызвать стресс, и заканчивая исследованием влияния глобальных климатических изменений.

Быстро, просто и доступно

Для детальной картины и закрепления знаний вам, читатель, будут предложены еще пять статей с подробнейшими теоретическими выкладками и практическими инструкциями по использованию флуориме-трии и флуориметров в практике агробизнеса.

После публикации первой статьи в редакцию звонят заинтерисованные в приобретении флуориметра агрономы. Мы сейчас связываемся с зарубежным дистрибьютором, который торгует по заводским ценам и может организовать обучение. Все ваши запросы будут удовлетворены.

ВИДЕО
СОБЫТИЯ